受國家衛生健康委員會委托，國家食品安全風險評估中心承擔新食品原料、食品添加劑新品種、食品相關產品新品種（以下簡稱“三新食品”）技術評審工作。按照國家衛生健康委員會和農業農村部的相關要求，對符合“三新食品”申報條件的、生產加工過程中涉及遺傳修飾微生物的產品，申請人應按照附件要求在新食品原料、食品相關產品新品種申報資料的生產工藝部分，食品添加劑新品種安全性評估資料的生產工藝部分提交相關資料。

——附件

食品加工用遺傳修飾微生物安全性評價申報材料要求（試行）

　　申請人申報使用遺傳修飾微生物生產新食品原料、食品添加劑新品種和食品相關產品新品種（以下簡稱“三新食品”），產品中不含有新引入基因片段和遺傳修飾微生物時，應按本文件提交相關資料。

　　1. 產品信息

　　1.1 產品的組成、目標產物含量等檢測數據

　　1.2 產品中外源基因殘留檢測數據

　　應詳細描述生產過程中去除外源基因的處理工藝步驟和參數，并提供產品中無外源引入基因殘留的檢測報告。采用聚合酶鏈式反應（PCR）方法對生產菌株的特定脫氧核糖核酸（DNA）片段（包括目的基因、報告基因、標記基因等）進行檢測。PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴增和質量控制要求見附件1。

　　1.3 產品中遺傳修飾微生物殘留檢測數據

　　應詳細描述生產過程中滅活和去除遺傳修飾微生物的工藝步驟和參數，并提供產品中無遺傳修飾微生物活細胞殘留的檢測報告。采用微生物培養法對產品進行遺傳修飾微生物活細胞檢測。具體的樣品采集、樣品前處理、培養和觀察、菌落計數、質量控制和鑒定確認要求見附件2。

　　1.4 環境風險控制措施及效果

　　應提供無環境釋放風險承諾書及其支持資料，包括但不限于生產過程中確保遺傳修飾微生物及其外源基因不會進入環境和發生基因轉移的防控措施，及其效果評價數據和報告（如生產過程中產生的廢氣、廢水、廢渣中無可繁殖、可轉移的遺傳修飾微生物殘留的至少3批次檢測數據）。

　　1.5 產品分類說明

　　依據以上數據及報告，對產品做出分類。Ⅰ類為純化產品，Ⅱ類為復合產品。

　　2. 遺傳修飾微生物相關信息 

　　2.1 基本信息

　　名稱（包括中文名、拉丁名、別名等）、菌株號、來源及用途。

　　2.2 分類學及鑒定資料

　　提供基于表型、基因型和最新測序技術鑒定到種或亞種水平的鑒定報告。

　　2.3 生物學特性資料

　　包括但不限于遺傳修飾微生物的表型及顯微鏡下特征、理化特性等。

　　2.4 生長環境條件資料

　　提供遺傳修飾微生物生長的適宜培養基及培養條件（包括但不限于培養時間、培養溫度和濕度、需氧情況、光照等），以及遺傳修飾微生物保藏及復壯方法等相關資料。

　　2.5 其他國家法規資料

　　提供其他國家已經批準或認可的該遺傳修飾微生物生產產品的相關法規資料。

　　2.6 食品加工用遺傳修飾微生物的安全性評價

　　2.6.1 遺傳修飾微生物在自然界的存活能力，遺傳物質轉移到其他生物體的能力和可能后果；

　　2.6.2 遺傳修飾微生物的安全性

　　（1）基于全基因組測序進行的毒力基因、耐藥基因、毒素產生相關基因等分析；

　　（2）遺傳修飾微生物的致病性、耐藥性和產毒能力試驗報告；

　　（3）遺傳修飾微生物新引入基因表達產物應提供與已知毒性蛋白或毒素的同源性生物信息學比對資料，以及與已知致敏原的同源性生物信息學比對資料；

　　（4） 遺傳修飾微生物新引入基因表達產物為非蛋白質類的產品，還應提供至少3批次樣品蛋白殘留數據；

　　（5）結合全基因組測序數據，分析潛在的脫靶位點與脫靶情況，如有脫靶情況發生，應分析可能造成的非預期效應；

　　（6）其他安全性資料。

　　2.6.3 確定遺傳修飾微生物的安全等級。

　　3. 受體微生物的安全性評價

　　3.1 背景資料

　　3.1.1 名稱（包括中文名、拉丁名、別名等）、菌株號、來源；

　　3.1.2 分類學資料；

　　3.1.3 明確是天然野生菌種還是人工培養菌種，如為人工培養菌種，應提供原始菌株的信息；

　　3.1.4 安全性背景資料：包括但不限于在國內外的應用情況，長期安全應用記錄，對人類健康或生態環境是否產生過不良影響，是否有演變為有害生物的可能性。

　　3.2 生物學特性

　　3.2.1 生長周期和世代時間；

　　3.2.2 繁殖方式和繁殖能力；

　　3.2.3 適宜生長的營養要求；

　　3.2.4 在環境中定殖、存活和傳播的方式、能力及其影響因素；

　　3.2.5 對人體健康和動物的潛在風險（包括毒性、致病性、耐藥性等）；

　　3.2.6 其他生物學特性。

　　3.3 適應的生態環境

　　3.3.1 在國內的地理分布和自然生長環境，其自然分布是否會因某些條件的變化而改變；

　　3.3.2 生長所需的生態環境條件，包括溫度、濕度、酸堿度、光照、空氣等；

　　3.3.3 是否具有生態特異性，如在環境中的適應性等；

　　3.3.4 與生態系統中其他微生物的生態關系，是否受人類和動物病原體（如病毒）的侵染。包括生態環境的改變對這種（些）關系的影響以及是否會因此而產生或增加對人類健康和生態環境的不良影響；

　　3.3.5 對生態環境的影響及其潛在風險。

　　3.4 遺傳變異

　　3.4.1 遺傳穩定性；

　　3.4.2 質粒狀況，質粒的穩定性及其潛在風險；

　　3.4.3 轉座子狀況及其潛在風險；

　　3.4.4 是否有發生遺傳變異而對人類健康或生態環境產生不良影響的可能性；

　　3.4.5 在自然條件下與其他微生物（特別是病原體）進行遺傳物質交換的可能性。

　　3.5 其他資料

　　3.6 安全等級

　　4. 基因操作的安全性評價

　　4.1 食品加工用遺傳修飾微生物中引入或修飾性狀和特性的描述

　　4.2 實際插入或刪除序列的資料

　　4.2.1 插入序列的大小和結構，確定其特性的分析方法；

　　4.2.2 刪除區域的大小和功能；

　　4.2.3 目的基因的安全性；

　　詳細描述目的基因的供體來源、核苷酸序列和推導的氨基酸序列、功能和安全性。

　　（1）結構：完整的DNA或反轉錄脫氧核糖核酸（cDNA）序列和推導的氨基酸序列；

　　（2）供體微生物的來源；

　　（3）供體微生物的生物學特性及生物學功能等；

　　（4）安全性：從供體微生物特性、安全使用歷史、基因結構、毒性、致病性、耐藥性、功能等方面綜合描述目的基因的安全性。

　　4.2.4 插入序列的拷貝數。

　　4.3 載體信息

　　載體的名稱和來源，載體特性和安全性，是否可向自然界中不含有該類基因的微生物轉移。構建載體圖譜，詳細注明表達載體所有元件的名稱、位置和酶切位點。

　　4.4 載體中插入區域各片段的資料

　　4.4.1 啟動子和終止子的供體生物的名稱、大小、DNA序列、功能、安全應用記錄；

　　4.4.2 標記基因和報告基因的供體生物的名稱、大小、DNA序列、功能、安全應用記錄；

　　4.4.3 其他表達調控序列的名稱及其來源（如人工合成或供體生物名稱）、大小、DNA 序列、功能、安全應用記錄。

　　4.5 基因操作方法

　　4.6 遺傳穩定性

　　4.6.1 目的基因整合的穩定性：采用PCR等方法擴增外源基因片段，測定擴增產物的序列，分析外源基因片段的插入情況或微生物基因缺失情況，提供不少于轉接傳代5代的試驗數據；

　　4.6.2 目的基因表達的穩定性：采用蛋白質印記（Western–Blot）、質譜、色譜等方法，分析表達產物中外源基因表達的穩定性，提供不少于轉接傳代5代的試驗數據。

　　4.7 目的基因的檢測和鑒定技術

　　4.8 確定基因操作的安全類型

附件1 食品加工用遺傳修飾微生物產品中生產菌株DNA檢測

　　采用PCR方法對生產菌株特定DNA片段（如目的基因、報告基因、標記基因等）進行檢測。PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴增和質量控制要求如下：

　　1. 樣品采集

　　每個遺傳修飾微生物產品應至少包括3個批次，每個批次至少取3個樣品進行檢測。樣品應從工業化生產線采集，記錄采樣點所處的具體生產環節。若尚無工業化產品，可采用中試產品，但應明確中試生產工藝（發酵及后處理工藝）具有工業化生產工藝的代表性。

　　2. DNA提取

　　從至少1 g（mL）樣品中提取DNA。若上游發酵中間產品濃度高于終產品濃度，可使用上游發酵中間產品提取DNA。

　　應采用適合于生產菌株各類細胞形式（如菌體細胞、芽胞）的DNA提取方法，確保能從產品中提取到可能殘留的DNA。

　　3. PCR擴增

　　針對生產菌株的特定DNA片段設計特異性引物，擴增產物不應超過1 Kb。應詳細描述生產菌株的特定DNA片段、特異性引物、聚合酶以及擴增條件等信息。

　　若生產菌株含有作為報告基因/標記基因的耐藥基因，可設計多對引物以確保擴增產物應覆蓋耐藥基因的完整DNA片段。

　　4. 質量控制

　　PCR檢測時應當包括以下對照和靈敏度測試：

　　（1）將直接從生產菌株中提取的總DNA作為PCR擴增的陽性對照；

　　（2）不含目的基因的微生物DNA作為陰性對照；

　　（3）試驗過程中為排除PCR抑制劑、核酸酶等的存在，將直接從生產菌株提取的總DNA添加至從樣品中提取的DNA作為PCR擴增的質控對照；

　　（4）將直接從生產菌株提取的總DNA梯度稀釋后，分別添加至樣品中，提取DNA并進行PCR擴增，計算檢測限；

　　（5）檢測閾值應不高于10 ng DNA/g（mL）樣品。

附件2 食品加工用遺傳修飾微生物產品中無活體生產菌株評價

　　采用微生物培養法檢測產品中是否存在遺傳修飾微生物活細胞。具體的樣品采集、樣品前處理、培養和觀察、菌落計數、質量控制和鑒定確認要求如下：

　　1. 樣品采集

　　每個遺傳修飾微生物產品應至少包括3個批次，每個批次至少取3個樣品進行檢測。樣品應從工業化生產線采集，記錄采樣點所處的具體生產環節。若尚無工業化產品，可采用中試產品，但應明確中試生產工藝（發酵及后處理工藝）具有工業化生產工藝的代表性。

　　2. 樣品前處理

　　每個樣品至少取25 g（mL）進行前處理后制備檢液。固體樣品：取25 g，加入225 mL滅菌生理鹽水，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1∶10稀釋的檢液。水溶性液體樣品：取25 mL（g），加入225 mL滅菌生理鹽水，混勻后制成1∶10稀釋的檢液。取1 mL上述檢液于適宜的培養基中進行生產菌株活細胞培養檢測，需設定10個平行樣，用于計算1 g（mL）樣品中待測微生物的含量。

　　3. 培養和觀察

　　將上述平皿置于適宜的條件下培養一定時間后，觀察生產菌株存活和生長情況。

　　4. 菌落計數

　　計算10個平行樣平皿中待測微生物的菌落總數，并表示為1g（mL）樣品中待測微生物的含量。

　　5. 質量控制

　　培養檢測時，每批次樣品應設置陽性對照，即在每批次的1個樣品中接種較低數量的活體生產菌株（如每個平皿30~300個菌落），以證明所用培養基和培養條件適合于產品中活體生產菌株的生長。

　　應考慮檢測方法的特異性，以避免樣品中其他微生物的污染和干擾。

　　6. 鑒定確認

　　結果報告應提供菌落培養圖片。

　　樣品經培養后，若平皿上長出與陽性對照形態相似的菌落，應通過鑒定確認其是否為生產菌株。